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白色念珠菌微衛星 CAI 多樣性對環境壓力敏感性與毒性因子 ECE1 表現之影響

為了解決marker複數的問題，作者陳冠中 這樣論述：

背景：白色念珠菌 (Candida albicans) 為人類常見之伺機性感染病原真菌，其侵入性感染與菌血症會導致人體的死亡，死亡率可達 40%。微衛星序列分析可應用於微生物之基因型分型，而微衛星 CAI (Candida albicans I) 座落於基因 RLM1 的 3’ 端，由麩醯胺酸對應之密碼子 CAA/G短串聯片段所組成。Rlm1p 屬於 MADS box轉錄因子家族，負責調控與細胞壁完整性相關基因表達，但其在白色念珠菌參與致病機轉角色尚未完全釐清。位居轉錄活化功能區域的微衛星 CAI，其 CAA/G 數目變異可能影響其轉錄因子作用。根據以微衛星 CAI 為標記之流行病學調查文獻

顯示攜帶高重複數 CAA/G 菌株與念珠菌外陰道炎感染重複性感染有關，且本團隊分析發現 clade 17 系群中 CAA/G 重複數 ≥ 29 感染者具有明顯較高 30 天致死率。目的：分析白色念珠菌同源 CAI 基因型臨床菌株對細胞壁完整性相關環境壓力敏感性之影響，並建立相同基因背景之 RLM1 基因轉殖菌株以研究 CAA/G 重複數對上述環境壓力耐受程度以及下游毒力基因 ECE1 表現之影響。材料方法：以菌落微滴試驗分析攜帶不同 CAA/G 重複數之林口長庚醫院菌血症分離株對單一環境壓力，包括剛果紅、SDS 與 caspofungin，或是抵抗剛果紅壓力劑合併第二種壓力劑之敏感性，包含醋酸

、過氧化氫、SDS 與 menadione。將攜帶 11 次、25 次、35 次與 39 次 CAA/G 重複數之 RLM1 基因選殖構築四環黴素調控基因表達卡匣以電穿孔送入白色念珠菌 BRY429 (rlm1Δ/rlm1Δ) 與 ADH1 基因進行同源重組，並以 nourseothricin 進行篩選，存活菌落以 yeast colony PCR 確認轉殖成功與否，並經生長曲線分析轉殖菌株生長速度排除外源性 DNA 重組對菌體之影響。以菌落微滴試驗測試不同 CAI 基因型之 RLM1 基因轉殖菌株對於上述單一環境壓力或是合併剛果紅與第二壓力劑之敏感性。利用 RT-qPCR 分析參考菌株與轉殖

菌株經不同濃度之 doxycycline 誘導 1 小時後基因 RLM1 與 ECE1 之相對表現量，同時以西方墨點法分析其誘導 3 小時後基因產物之含量。結果：自林口長庚醫院菌血症病患分離之 CAI 同源二倍體基因型菌株對不同的環境壓力劑敏感性趨勢不一致，基因型 CAI 11-11 菌株較其他基因型菌株對 SDS 敏感性較高，而基因型 CAI 35-35 菌株對抗真菌劑 caspofungin 敏感性較其他基因型菌株高；而在含有剛果紅與其他壓力劑合併環境下，CAA/G 重複數較高菌株較可耐受 SDS、H2O2 和 menadione 造成之壓力，對醋酸敏感性則無明顯差異，其中又以基因型 CA

I 25-25 菌株耐受性最佳。白色念珠菌四環黴素調控 RLM1 基因轉殖菌株經 yeast colony PCR 篩選確認，且分析各菌株之世代分裂所需時間與親株 BRY429 無顯著性差異。誘導表現 RLM1 之轉殖菌株在分別含有剛果紅、calcofluor white、caspofungin 或剛果紅/SDS 合併壓力環境下，存活菌量無法回復與野生型菌株 CAF2-1 相似之生長量，且未能發現 CAA/G 重複數與環境壓力敏感性之關聯。經不同濃度 doxycycline 誘導之轉殖菌株皆可偵測 RLM1 基因之表現，但未能以西方墨點法觀測到 6× His-tagged Rlm1p，因此無法

推斷麩醯胺酸重複數與 ECE1 表現量之相關性。結論：白色念珠菌可能藉由改變 CAI 區域以適應細胞壁壓力環境，但未能以本研究構築之轉殖菌株證明臨床菌株之結果以及與毒力基因 ECE1 之相關性。